کشت سلولی چیست؟

به فرایند کشت کنترل شده سلول‌های پروکاریوتی یا یوکاریوتی در فلاسک فیلتر دار یا فلاسک بدون فیلتر و یا پلیت کشت سلول توسط محیط کشت مناسب، گفته می شود. این اصطلاح بیشتر در مورد کشت سلول‌های جانوران پر سلولی کاربرد دارد. برای کشت سلول‌های جانوری از محیط کشت‌های خاصی استفاده می‌شود. معمولا سلول‌های جانوری را در دمای ۳۷ درجه سانتیگراد و در تجهیزاتی نظیر انکوباتور‌های CO2  دار کشت می‌دهند. کشت یاخته های جانوری باید در شرایط کاملا آسپتیک(ضد عفونی) انجام شود چون رشد این سلول‌ها بسیار کند تر از رشد باکتری‌ها و مخمرها است و امکان آلودگی محیط کشت در آن وجود دارد. برای جلوگیری از رشد باکتری‌ها گاهی از آنتی بیوتیک‌هایی مانند پنیسیلین، استرپتومایسین و یا جنتامایسین استفاده می‌شود.

محیط کشت Growth medium محیط دارای مایع یا ژل می‌باشد که به منظور رشد دادن میکروب‌ ها، یاخته ‌ها یا سلول یا حتی گیاهان کوچک مورد استفاده قرار می‌گیرد. محیط ‌های کشت به‌طور معمول شامل دو دسته می‌باشند،کشت سلول ( cell culture ) که در آن از یاخته‌های ویژه‌ای استفاده می‌نمایند که از گیاهان و حیوان‌ها به دست آمده‌اند و محیط کشت میکروبی (خردزیستی)  microbiological culture که به ویژه به منظور رشد دادن میکروب‌ها استفاده می‌گردد. دو نوع محیط کشت اصلی وجود دارد یکی از آنها برای کشت سلولی مورد استفاده قرار می گیرد و دیگری برای کشت میکروبیولوژیکی  که برای رشد میکروارگانیسم هایی مانند باکتری یا قارچ استفاده می شود. متداول ترین محیط های رشد برای میکروارگانیسم ها نوترینت براث و پلیت های جامد آگار هستند.

محیط کشت سلولی چیست؟

محیط‌های کشت سلولی به ‌طورکلی منبع مناسبی از انرژی و ترکیباتی را تشکیل می‌دهند که چرخه سلولی را تنظیم می‌کنند. یک محیط کشت معمولی از مجموعه‌ای از اسیدهای آمینه، ویتامین‌ها، نمک‌های معدنی، گلوکز و سرم به‌عنوان منبع رشد، هورمون‌ها و فاکتورهای رشد تشکیل‌شده است. علاوه بر تامین مواد مغذی، سرم به حفظ pH محیط‌ کشت و اسمولالیته نیز کمک می‌کند.

انواع محیط‌های کشت سلولی

سلول‌های حیوانی را می‌توان با استفاده از یک محیط کاملاً طبیعی یا یک محیط مصنوعی / سنتتیک به همراه برخی محصولات طبیعی کشت داد.

محیط‌ های کشت طبیعی

محیط‌های کشت طبیعی فقط از مایعات بیولوژیکی طبیعی تشکیل‌شده‌اند. محیط‌های کشت طبیعی برای طیف گسترده‌ای از کشت سلول‌های حیوانی بسیار مفید و مناسب هستند. مهم‌ترین نقطه ‌ضعف محیط‌های کشت طبیعی، قابلیت تکثیر ضعیف آن به دلیل عدم آگاهی از ترکیب دقیق این محیط‌های کشت طبیعی است

محیط‌های کشت مصنوعی

محیط‌های کشت مصنوعی یا سنتتیک با اضافه کردن مواد مغذی (اعم از آلی و معدنی)، ویتامین‌ها، نمک‌ها، گازهای O2 و CO2، پروتئین‌های سرم، کربوهیدرات‌ها، کوفاکتورها تهیه می‌شوند. محیط‌های کشت مصنوعی مختلفی برای ارائه یک یا یکی از اهداف زیر تولیدشده است:

1-زنده ماندن فوری (محلول نمک متعادل، با pH اختصاصی و فشار اسمزی.

2- بقای طولانی‌مدت (یک محلول نمک متعادل همراه با فرمولاسیون مختلف ترکیبات آلی و / یا سرم)

3- رشد نامحدود

4- عملکردهای تخصصی

محیط‌های کشت مصنوعی به چهار گروه، دسته‌بندی می‌شوند:

محیط‌های کشت حاوی سرم

سرم گاوی FBS یا Fetal Bovine Serum شایع‌ترین مکمل در محیط کشت سلولی حیوانات است. به‌عنوان یک مکمل کم‌هزینه برای تهیه یک محیط کشت بهینه استفاده می‌شود. سرم به‌عنوان حامل‌ها یا شلاتور برای مواد مغذی محلول و غیر محلول در آب، هورمون‌ها، فاکتورهای رشد و مهارکننده‌های پروتئاز عمل می‌کند و خنثی‌کننده مواد سمی می‌باشد.

محیط‌های کشت بدون سرم

وجود سرم در محیط‌های کشت دارای اشکالات زیادی است و می‌تواند به تفسیرهای اشتباه در مطالعات ایمونولوژیکی منجر شود. تعدادی از محیط‌های کشت بدون سرم تولیدشده‌اند. این محیط‌های کشت (محیط کشت سلول های بنیادی) به‌طورکلی برای حمایت از کشت یک نوع سلول واحد، مانند Knockout Serum Replacing و Knockout DMEM از شرکت Thermo Fisher Scientific و محیط کشت mTESR1 از شرکت Stem Cell Technologies برای کشت سلول‌های بنیادی دارای مقادیر مشخص‌شده از فاکتورهای رشد خالص، لیپوپروتئین‌ها و پروتئین‌های دیگر (که در محیط‌های دیگر معمولاً توسط سرم تهیه می‌شوند) تهیه‌شده‌اند. ازآنجاکه اجزای موجود در این محیط‌های کشت شناخته‌شده‌اند، از این محیط‌های کشت به‌عنوان «محیط‌های کشت تعریف‌شده» نیز یاد می‌شود.

محیط‌های کشت تعریف‌شده شیمیایی

این محیط‌های کشت حاوی مواد معدنی و آلی فوق‌العاده خالص و بدون آلودگی هستند و ممکن است حاوی مواد افزودنی خالص پروتئین باشند. این ترکیبات توسط مهندسی ژنتیک با افزودن ویتامین‌ها، کلسترول، اسیدهای آمینه خاص و اسیدهای چرب در باکتری‌ها یا مخمرها تولید می‌شوند.

محیط‌های کشت بدون پروتئین

محیط‌های کشت بدون پروتئین حاوی پروتئین نیستند و فقط حاوی ترکیبات غیر پروتئینی هستند. در مقایسه با محیط‌های کشت حاوی سرم، استفاده از محیط‌های کشت بدون پروتئین باعث رشد بهتر سلول و بیان پروتئین می‌شود و تخلیص پایین‌دستی از هر محصول بیان‌شده را تسهیل می‌کند. فرمولاسیون‌هایی مانند محیط کشت سلولیMEM ،RMPI-1640 ،DMEMفاقد پروتئین هستند و در صورت لزوم مکمل پروتئین تهیه می‌شود.

تفاوت های محیط کشت

تمایز مهم بین انواع محیط های رشد تعریف شده و تعریف نشده بودن آنها است. یک محیط کشت تعریف شده حاوی مقدار مشخصی از همه مواد تشکیل دهنده است. برای میکروارگانیسم ها  محیط ها از عناصر کمیاب و ویتامین های مورد نیاز میکروب و به ویژه منابع کربن و ازت تشکیل می شوند. گلوکز یا گلیسرول اغلب به عنوان منبع کربن و نمک آمونیوم یا نیترات به عنوان منابع نیتروژن معدنی مورد استفاده قرار می گیرند. یک محیط کشت تعریف نشده حاوی ترکیبات پیچیده ای مانند عصاره مخمر یا هیدرولیزات کازئین است که از ترکیب بسیاری از مواد شیمیایی با نسبت نامعلوم تشکیل شده است. برخی از میکروارگانیسم ها هرگز در محیط تعریف شده کشت نشده اند.

محیط کشت بلاد آگار (آگار خوندار ) (Blood agar)

محیط کشت بلاد آگار عمومی است که به منظور تکثیر و جدا سازی باکتری های بیماریزا بخصوص باکتری هایی که برای رشد به مواد مغذی نیاز دارند، بکار می رود. بعلاوه در این محیط وجود همولیزین در باکتری ها را نیز می توان کاوش کرد. پس از اتوکلاو محیط پایه، هنگامی که درجه آن تا حدود ۵۰ درجه سانتیگراد رسید، خون دفیبرینه گاو را به نسبت ۵ تا ۷ درصد به آن اضافه نموده و با رعایت شرایط استریل در پلیت های استریل می ریزیم. ممکن است بسته به نوع باکتری یکی از سه حالت ذیل مشاهده گردد:

• همولیز کامل β: باکتری واجد آنزیم همولیزین بوده و اطراف پرگنه منطقه شفافی ایجاد می گردد.
• همولیز ناقص α: باکتری واجد آنزیم همولیزین بوده ولی نسبت لیز کمتر از ۵۰ درصد می باشد و اطراف پرگنه هاله سبز رنگ ایجاد می گردد.
• عدم همولیزγ : باکتری فاقد آنزیم همولیزین می باشد.

محیط کشت آگار شکلاته (Chocolate agar)

اگر به محیط پایه آگار خوندار ( بلاد آگار )، هنگامی که درجه حرارت آن بعد از اتوکلاو در حدود ۸۰-۷۰ درجه سانتیگراد باشد، خون دفیبرینه گاو اضافه کنیم، محیط کشت آگار شکلاته بدست می آید. در این محیط ب علت اینکه گلبولهای قرمز خون در اثر حرارت متلاشی شده و اجزای آن خارج گشته، برای رشد باکتری هایی نظیر هموفیلوس و نایسریاها که نیاز بیشتری به مواد غذایی آماده دارند مناسب می باشد. همانند محیط کشت آگار خوندار Blood agar بسته به نوع باکتری همولیز و یا همولیز ناقص و عدم همولیز ایجاد می گردد.

محیط کشت بریلیانت گرین آگار (Briliant green agar)

محیطی است انتخابی و برای جداسازی گونه های سالمونلا بکار می رود. این محیط از رشد بسیاری از باکتری های روده ای (انتروباکتریاسه) به جز سالمونلا جلوگیری می نماید. در صورتی که Ecoli، کلبسیلا و پروتئوس و سایر انترو باکتریاسه ها رشد نمایند، به دلیل اینکه قند لاکتوز و یا سوکروز و یا هر دو را تخمیر می نمایند و تولید اسید می کنند، در مجاورت معرف رنگی فنل رد به رنگ زرد در می آیند. در صورتی که باکتری های لاکتوز منفی مانند سالمونلا رشد نمایند، به دلیل عدم تخمیر قند در مجاورت معرف، محیط به رنگ ارغوانی در می آید.

محیط کشت مک کانکی آگار (مکانکی آگار) (Macconkey agar)

مکانکی آگار محیط انتخابی است که برای جداسازی و تعیین هویت باکتری های گرم منفی می باشد. املاح صفراوی و کریستال ویوله مانع از رشد باکتری های گرم مثبت می شوند. باکتری های تخمیر کننده ی لاکتوز (لاکتوز مثبت ها) کلنی هایی به رنگ ارغوانی و باکتری هایی که قادر به تخمیر نیستند (لاکتوز منفی ها) کلنی هایی بی رنگ ایجاد می نمایند. رنگ ارغوانی کلنی های باکتری های لاکتوز مثبت مربوط به واکنش اسیدی است که در نتیجه تخمیر قند لاکتوز در مجاورت املاح صفراوی و جذب نوترال رد حاصل شده است. معرف نوترال رد در محیط قلیایی بی رنگ و در محیط اسیدی قرمز رنگ است.

محیط کشت سابور دکستروز آگار (Saborad Dextrose agar)

محیط انتخابی برای تکثیر قارچها می باشد که بسیاری از باکتری ها نیز در این محیط رشد می کنند. انتخابی بودن این محیط برای قارچها بر اساس PH پایین و همچنین مواد غذایی ناچیز آن است.

محیط کشت DNASE

باکتری هایی که حاوی آنزیم دی اکسی ریبو نوکلئاز باشند، هاله صورتی رنگی اطراف کلنی ها پدید می آورند. تولوئیدن آبی در حضور DNA سالم به رنگ آبی است. ولی در صورت ریختن HCL نرمال موجب تخریب مولکول DNA شده و این ترکیب به رنگ صورتی در می آید.

محیط کشت مولر هینتون آگار (Mueller hinton agar)

کاربرد اصلی این محیط جهت تعیین حساسیت آنتی بیوتیکی باکتری ها (آنتی بیوگرام) به روش دیسک می باشد. بسیاری از باکتری هایی که سخت رشد Fastisious می باشند، نظیر Neisseria meningitidesN.gonorrhoeae در آن رشد می یابند.

محیط کشت فلچر (Flecher’s medium)

این محیط برای جداسازی و نگهداری لپتوسپیراها بکار می رود. پس از استریلیزه کردن و خنک نمودن محیط، به آن ۸۰ میلی لیتر سرم خرگوش استریل اضافه نموده، سپس به مقدار ۷-۵ میلی لیتر در لوله های استریل ریخته به مدت ۳۰ دقیقه در حرارت ۵۶ درجه سانتیگراد قرار می دهیم تا عامل مکمل موجود در سرم غیر فعال گردد. برای جداسازی لپتوسپیرا، نمونه های خون-ادرار و نسج مشکوک را در این محیط کشت داده و در حرارت ۲۹ درجه سانتیگراد به مدت ۳۰ روز انکوبه می نماییم. متناوبا از کشت گسترش تهیه کرده و بوسیله میکروسکوپ با زمینه تاریک کشت را کنترل می نماییم. در اثر تکثیر لپتوسپراها کدورت جزئی در محیط به وجود می آورند که پیدایش یک حلقه شیری رنگ در قسمت بالای محیط می تواند حاکی از رشد لپتوسپرا باشد.

محیط کشت متیل رد – وژوسپروسکار Methylred-Vegesproskaure broth) MR-VP):

این محیط ملاک آزمایشی می باشد برای تفکیک مسیرهای تخمیر گلوکز و نهایتا ایجاد ترکیبات اسیدهای آلی بوتاندیول یا بوتیلن گلایکول بوده که از این آزمایش در تفکیک و تشخیص کلی فرم ها از هم مورد استفاده قرار می گیرد. همچنین در تمایز بین استافیلوکوک و میکروکوک و گونه های آن از این محیط استفاده می شود. آزمایشMR: پس از انجام کشت و انکوباسیون ۳۷ درجه سانتیگراد به مدت ۴۸ ساعت، مقدار ۶/۰ میلی لیتر معرف رنگی متیل رد اضافه نموده و در صورت ظهور رنگ قرمز آزمایش MR مثبت می باشد. در صورت پیدایش رنگ نارنجی آزمایش MR مثبت ضعیف می باشد و در صورت عدم تغییر و پایداری رنگ زرد آزمایش MR منفی می باشد.

نتیجه:

ظهور رنگ قرمز: آزمایش مثبت (PH=4/4)

ظهور رنگ نارنجی: آزمایش مثبت ضعیف (PH=5/3)

ظهور رنگ زرد: آزمایش منفی (PH=5/3)

طرز تهیه معرف MR

1- متیل رد ۰۴/۰ گرم

۲- اتانول ۴۰ میلی لیتر

۳- آب مقطر ۱۰۰ میلی لیتر

متیل رد را در اتانول حل نموده و به حجم ۱۰۰ میلی لیتر می رسانیم.

آزمایش VP: به لوله کشت داده شده و انکوبه شده حدود ۶/۰ میلی لیتر معرف آلفا نفتول (معرف A) و مقدار ۲/۰ میلی لیتر محلول پتاس (معرف B) اضافه کرده و خوب تکان می دهیم. اگر تغییر رنگ صورت نگرفت آن را به مدت سی دقیقه به حال خود گذاشته و در صورتی که ظهور رنگ صورتی تا قرمز پدیدار شود، آزمایش VP مثبت و اگر تغییر رنگی صورت نپذیرد، آزمایش VP منفی خواهد بود.

مثبت: ظهور رنگ صورتی تا قرمز

منفی: تغییر رنگی صورت نمی گیرد.

طرز تهیه معرف VP:

معرف A:

1- آلفانفتول: ۵ گرم

۲- الکل اتلیک مطلق: ۱۰۰ میلی لیتر

محلول نباید تیره تر از رنگ کاه (نی) شود. در صورت لزوم باید مجددا تقطیر گردد.

معرف B:

1- هیدروکسید پتاسیم: ۴۰ گرم

۲- آب مقطر: ۱۰۰ میلی لیتر    

محیط کشت سلنیت F براث

محیط مغذی است برای جدا سازی گونه های سالمونلاها. که یک محیط غنی کننده Enrichment می باشد که حاوی سلنیت سدیم است که یک نمک صفراوی است و مانع از رشد باکتری های گرم مثبت و بسیاری از باکتری های گرم منفی می گردد. میزان تکثیر سالمونلا در این محیط طی ۲۴-۱۲ ساعت اول از رشد هر یک از باکتری های روده ای سریعتر است. بنابر این کشت ثانوی باکتری در محیطهای دیگر باید ظرف همان روز (۲۴-۱۲ ساعت) انجام گردد. باید توجه داشت این محیط در صورت ماندن و کهنه شدن خراب شده و رنگ آن به صورتی می گراید. بنابر این هرچه کم رنگتر باشد، تازه تر و برای کشت مناسبتر خواهد بود.

محیط کشت ( Sulfide Indol Motility ( SIM:

با استفاده از این محیط سه خصوصیت مختلف باکتری را می توان سنجید و در تمام باکتری ها می توان بکار برد. به طریقه Stab تا یک سانتی متری انتهای لوله به وسیله آنس نوک تیز در این محیط کشت می دهیم.

اساس آزمایش:

مواد اولیه تولید اندول یعنی اسید آمینه تریپتوفان در پپتونهای محیط موجود است. هیدروژن سولفوره و سولفات نیز در محیط موجود است. قوام نیمه جامد بودن محیط نیز اجازه پخش شدن و در نتیجه کدر نمودن محیط را به باکتری های متحرک می دهد.

ایجاد هیدروژن سولفوره توسط باکتری به صورت سیاه شدن محیط ظاهر می گردد.

در صورت متحرک بودن باکتری کشت شده، سیاهی نیز تمام محیطی که باکتری پخش گردیده است، انتشار می یابد. سیاه شدن محصول واکنش هیدروزن سولفوره تولید شده با سولفات آهن و تشکیل رسوب سولفوره آهن سیاه رنگ می باشد. با اضافه کردن یک میلی لیتر معرف کواکس Covacs و یک میلی لیتر کلروفرم به کشت ۲۴ ساعته، ظهور رنگ ارغوانی در سطح کشت دلیل بر تولید ایندول توسط باکتری است. باکتری های که حاوی مجموعه آنزیم هایی که اصطلاحا تریپتوفاناز نامیده می گردند، باشند، قادرند طی سری واکنشهای شیمیایی تریپتوفان را اکسیده و اندول استیک تولید نمایند. حرکت باکتری بواسطه پخش شدن آن از مسیر خط کشت به اطراف و کدر نمودن محیط مشخص می گردد. باکتری های فاقد حرکت تنها مسیر خط کشت را که نمایان است، کدر می کنند. برای تعیین تولید اندول می توان از محیط تریپتوز نیز استفاده نمود.

روش آماده سازی معرف کواکس جهت تست اندول:

فسفو دی متیل آمینو بنزآلدئید: ۵ گرم

ایزو آمیل الکل: ۷۵ میلی لیتر

اسید کلریدریک: ۲۵ میلی لیتر

آلدئید را در الکل به آرامی حل نموده و از بنماری ۵۵-۵۰ درجه سانتیگراد استفاده نموده و به آن اسید اضافه رده و دور از نور و در ۴ درجه سانتیگراد نگهداری می نماییم. رنگ معرف باید از زرد روشن تا قهوه ای روشن باشد. بعضی از نمونه ها آمیل الکل کافی نیست و با آلدئید رنگ سیاه می دهد.

محیط آبگوشت حاوی ۵/۶ درصد نمک ۶٫۵% (Nacl broth)

استرپتوکوک های روده ای را که غلظت زیاد نمک را تحمل می کنند، می توان به کمک این محیط از سایر استرپتوکوک ها تشخیص داد.

تفسیر آزمایش:

از آنجا که تمام استرپتوکوک ها از تخمیر گلوکز اسید تولید می کنند در صورتی که این غلظت نمک را تحمل کنند و در این محیط رشد و تکثیر نمایند، از تخمیر گلوکز اسید تولید و محیط را به رنگ زرد در می آورند. عدم تغییر رنگ دلیل بر عدم تحمل نمک و عدم تکثیر باکتری است.

نتیجه:

ظهور رنگ زرد: مثبت

بدون تغییر رنگ: منفی